Semaine 3

Date : 17 février 2011

Partie I : Séparation des éléments du lait écrémé

 

Objectif : Le lait est constitué de trois principaux éléments soient les lipides, les glucides et les protéines. Puisque nous sommes rendues aux expériences sur le lait écrémé nous aurons qu'à extraire le lactose (glucide) et la caséine (protéine).

Séparer le caillé (caséine) du petit lait (solution de lactose)

Manipulations :

Mesurer 200 ml de lait écrémé et le placer dans un bécher de 600 ml.

103 ml = 200 ml       X= 194 g de lait écrémé

 X g        100 g

Placer le bécher contenant le lait dans un bain-marie et chauffer jusqu'à environ 40°C (vérifier la température avec un thermomètre dans le bécher)

Lorsque le lait a atteint les 40°C, retirez-le du bain-marie et ajouter lentement avec un compte-gouttes de l'acide acétique (1 volume d'acide acétique pur avec 10 volumes d'eau) en agitant continuellement.

 1 volume    = 5 ml CH3COOH

10 volumes      50 ml H2O

Ajouter de l'acide acétique dilué jusqu'à ce que la caséine ne précipite plus. 

Pour assurer une bonne coagulation, continuer à agiter le mélange en le refroidissant dans un bain d'eau froide.

Filtrer sous vide le caillé avec un filtre Büchner de 7 cm de diamètre muni d'un papier-filtre à filtration rapides (Whatman #4) monté d'une fiole conique à vide de 500 ml. (Ne pas utiliser une fiole plus petite, car le filtrat a tendance à mousser) 

Le caillé colle aux parois du bécher, donc il faut le rincer avec de l'eau distillée.

Placer la caséine et le papier-filtre (préalablement pesé) dans un verre de montre étiqueté et préalablement pesé.

Laisser sécher à l'air libre durant une semaine, jusqu'au prochain laboratoire.

Transférer le filtrat dans un erlenmeyer de 500 ml et y ajouter du carbonate de calcium (CaCO3) en poudre pour neutraliser l'acide acétique qui pourrait rester puisque celui-ci pourrait hydrolyser le lactose en galactose et glucose.

Masquer l'ouverture de l'erlenmeyer avec de la paraffine et mettre de côté pour le prochain laboratoire (cristallisation du lactose) 

 

Données :

Volume de lait écrémé utilisé : 200 ml

Masse de lait écrémé utilisé : 194 g

Masse verre de montre étiqueté + papier-filtre : 52,97 g

Masse papier-filtre (deuxième montage) : 0,35 g

Observations :

Durant l'addition d'acide acétique au lait, il y avait formation quasi instantanée de cristaux blancs ayant l'apparence de flocons de neige. En arrêtant le brassage, les «flocons» de caséine tombaient au fond et on pouvait distinguer le petit-lait qui est jaunâtre. 


Au début, la filtration sous vide du caillé était très rapide et très efficace, beaucoup plus que la filtration du caillé provenant du lait homogénéisé (3,25 %) à cause de l'absence de matière grasse. Après une quinzaine de minutes, la filtration était plus lente, mais elle était encore efficace. Il y avait beaucoup de mousse qui se formait à la base de la tige de l'entonnoir, qui finissait par disparaître une fois dans le filtrat jaunâtre (solution de lactose). Après 1h, le papier-filtre ne filtrait plus qu'à un rythme de 1 goutte toutes les 15-20 secondes, ce qui est beaucoup trop long puisqu'il nous restait encore 50 ml de mélange à filtrer. Nous avons donc décidé de commencer un deuxième montage de filtration sous vide sous une autre hotte. Pour transférer ce qui restait à filtrer dans le premier montage jusque dans le deuxième montage, nous avons utilisé une pipette et une spatule en métal.


Une fois la filtration terminée, nous avons transvidé le contenu des deux fioles conique dans un erlenmeyer de 500 ml et nous avons ajouté environ 5-6 g de poudre de carbonate de calcium. Nous croyons que le carbonate de calcium est ajouté pour neutraliser l'excès d'acide acétique qui pourrait y avoir dans la solution de lactose, ce qui empêcherait celui-ci d'être hydrolysé en galactose et en glucose. Nous avons donc utilisé du papier pH pour vérifier que le pH est neutre ou légèrement basique, ce qui indiquerait que tout l'acide aurait été neutralisé. Le papier pH indiquait que la solution était légèrement acide. Nous avons donc décidé d'ajouter encore 4-5 g de carbonate de calcium, mais le papier pH indiquait toujours légèrement acide. Nous avons donc décidé d'ajouter encore 2-3 g de carbonate de calcium, mais le ph indiquait toujours légèrement acide.

Après plusieurs recherches, nous avons confirmé notre hypothèse que le carbonate de calcium réagit avec l'acide acétique pour former un sel, du dioxyde de carbone et de l'eau en suivant la formule suivante:

2 CH₃COOH      +      CaCO₃      →      C₄H₆CaO₄      +      CO₂↑      +      H₂O

   Acide                   Carbonate            Acétate

Acétique                 de calcium          de calcium

Nous avons mis dans le lait écrémé moins de 50 ml d'acide acétique dilué (1 volume d'acide acétique pur avec 10 volumes d'eau), ce qui équivaut à 5 ml d'acide acétique pur.

Volume d'acide acétique pur : 5,0 ml

Masse volumique de l'acide acétique : 1,0495 g/ml

Masse molaire de l'acide acétique : 60,052 g/mol

Quantité maximale d'acide acétique : 0,08738 mol

Nous avons ajouté entre 11 et 14 g de carbonate de calcium dans la solution de lactose après la première filtration.

Masse molaire du carbonate de calcium: 100,086 g/mol
Quantité minimale de carbonate de calcium: 0,1099 mol 
Quantité maximale de carbonate de calcium: 0,1399 mol

La quantité de carbonate de calcium que nous aurions eu besoin pour neutraliser tout l'acide acétique de notre solution est de 0,4369 mol, soit presque quatre fois moins que ce que nous avons ajouté à notre solution. Après avoir ajouté le carbonate de calcium, le papier pH indiquait que notre solution était légèrement acide, ce qui est clairement impossible. Nous avons donc utilisé quatre autres papiers pH provenant de quatre rouleaux de papier pH différents et ils indiquaient tous légèrement acide. La seule hypothèse qui nous reste et qui est la plus probable est que nous n'avons pas utilisé le bon produit. La bouteille étiquetée CaCO₃ contenant de la poudre blanche ne contenait peut-être pas réellement du carbonate de calcium.


Sources d'erreur possibles 


Durant l'ajout d'acide acétique dilué, c'est difficile de savoir exactement quand la caséine ne précipite plus. Nous avons arrêté d'ajouter de l'acide acétique lorsque le petit-lait nous semblait le plus limpide possible lorsque le caillé précipitait dans le fond du bécher. Nous aurions pu mettre trop d'acide acétique, ce qui aurait pu hydrolyser le lactose en galactose et en glucose. Nous aurions pu aussi ne pas mettre assez d'acide acétique, ce qui aurait pu laisser de la caséine en solution dans le petit-lait.  


En versant le mélange du caillé et du petit-lait dans le filtre Büchner, il restait beaucoup de caséine collée aux parois du bécher de 600 ml et à la tige de verre. Nous avons utilisé de l'eau distillée pour les rincer, mais il en restait quand même un peu. 


Pour transférer ce qui restait à filtrer dans le premier montage de filtration jusque dans le deuxième montage, nous avons utilisé une pipette en plastique et une spatule en métal. Il restait un peu de caséine collée sur la paroi interne de la pipette et collée sur la spatule en métal. Nous avons aussi laissé tombé par mégarde quelques gouttes sur le comptoir. 


Une fois la filtration terminée, nous avons transvidé la caséine et le papier filtre dans le verre de montre prévu à cet effet, il restait beaucoup de caséine collée sur les parois du filtre Büchner. Nous en avons enlevé la grande majorité, mais il restait quand même un peu.   

Partie II : Avec le lait 3,25%

Récupération des cristaux de lactose du lait 3,25% :

1- Récupérer la fiole conique de 500 ml contenant les cristaux de lactose. 

2- Grattez les parois de la fiole conique avec une spatule pour déloger les cristaux. Filtrez les cristaux de lactose sur un filtre Büchner 7 cm de diamètre muni d’un papier filtre Whatman #1.

3- Transférer le solide et le filtre sur un verre de montre prépesé et laissez sécher à l’air libre durant 7 jours. 

Filtration de la solution caséines et graisses :

4- Récupérer la solution de caséines et de graisses entreposer dans le bécher de 400 ml. 

5- Faire le montage de filtration sous vide avec un entonnoir Büchner muni d’un papier filtre Whatman #1. 

6- Agiter vigoureusement la solution de graisses et de caséines à l’aide d’une tige de verre durant quelques minutes et ensuite, filtrez. Nettoyez le bécher avec environ 20 ml de diéthyléther .

7- Transférez les caséines du filtre sur un verre de montre prépesé et laissez sécher à l’air libre. 

8- Transférez le filtrat, soit les graisses, dans un ballon conique de 250 ml.

Isoler les graisses :

9- Récupérer le ballon contenant les graisses;

10- Évaporez complètement le solvant en vous servant d’un évaporateur rotatif. 

11- L’évaporation terminée, ajoutez 40 ml de diéthyléther au résidu du ballon.   

12- Ajouter 2,5 g de sodium anhydride. Boucher la fiole et attendre quelques minutes en agitant occasionnellement.

13- Utiliser un entonnoir conique muni d’un papier filtre #1 plié en quatre, filtrez la solution éthérée directement dans un ballon de 250 ml.

14- Évaporez le solvant à nouveau en utilisant l’évaporateur rotatif. 

15- Mettre un bouchon au ballon conique et entreposer sur un support à ballon afin de peser la masse de graisse.

Résultats :

Tableau des masses :

Étape/substance	Masse  (g)
3-Papier filtre et verre de montre	57,49
7-Papier filtre et  verre de montre	53,02
12-sodium anhydride	2,51

Tableau des volumes :

Étape/substance	Volume (ml)
11-Diéthyléther	42

Observations :

Lors de la filtration des cristaux de lactose, il est important de bien gratter les parois de la fiole afin de minimiser les pertes. De plus, il faut bien rincer avec de l’éthanol, toutefois, il est certain qu’il y aura des pertes, car le lactose se cristallise en de très fins cristaux. La filtration se fait très rapidement. La solution de caséine et de graisses s’est séparée en deux phases : la phase supérieure est translucide jaunâtre tandis que la phase inférieure est opaques blanche/jaune. L’agitation de la solution de caséine et des graisses est importante, car elle permet à la solution de s’homogénéiser afin de procéder à une meilleure filtration (éviter que la phase solide demeure au fond engendrant ainsi des pertes de graisses). Il y a des pertes à considérer, car malgré le nettoyage du bécher à l’aide de diéthyléther, il est demeuré des résidus graisseux dans le fond du bécher. Les caséines, après la filtration, étaient blanches/jaunes et avaient l’apparence d’une pâte granuleuse. 

Après la filtration, le filtrat, soit la solution contenant les graisses et des impuretés, étaient translucides d’une couleur jaunâtre. De plus, il était possible d’observer des petites bulles de graisses dans la solution de diéthyléther et d’acétone. La première évaporation du filtrat a permis d’évaporer les impuretés volatiles ainsi que les solvants. L’ajout de sodium anhydride permet de sécher la solution. La filtration permet d’éliminer les grosses impuretés dans les graisses/propriétés agglomérantes. Finalement, la dernière évaporation a permis d’éliminer les solvants afin d’y recueillir les graisses. Cependant, l’entreposage permettra une évaporation complète des solvants afin de récupérer seulement les graisses.

Semaine 2

Cristalliser le lactose (suite) :

1-Récupérer la solution de lactase de la semaine précédente et bien mélanger.

2-Ajouter un barreau magnétique à la solution et placer le bécher sur un agitateur magnétique chauffant. Ajuster le chauffage au maximum et l’agitation pour qu’elle soit vigoureuse. Concentrez ainsi la solution à moins de 75 ml en prenant soin de ne pas évaporer à sec. 

3-Une fois la solution concentrée, placez un bain-marie sous le bécher.

4-À l’aide d’un cylindre gradué de 100 ml ajouter environ 200 ml d’éthanol tout en continuant d’agiter. 

5-Ajouter environ 1,25 g de charbon activé et environ 2,5 g de terre de diatomées. 

6-Chauffer le mélange pendant environ 10 minutes en agitant de temps en temps.

7-Utiliser quatre entonnoirs coniques munis d’un papier-filtre plié en quatre

(Whatman# 4) pour chacun d’eux et mettre étendre sur les parois de chacun d’eux un peu de terre de diatomées (environ 0,5 g). Filtrer à chaud la solution éthanoïque dans quatre béchers de 400 ml; durant la filtration, continuer à garder le bécher de solution éthanoïque, terre de diatomées et charbon activé dans le bain-marie. À la fin, rincer le bécher et le filtre avec de l’éthanol.

-Transvider le filtrat des quatre montages à filtration dans un une fiole conique de 500 ml puis ajouter assez d’éthanol pour obtenir environ 280 ml de filtrat. Placez le bouchon sur la fiole conique afin de l’entreposer. Les cristaux seront récupérés la semaine suivante.

Séparer les caséines des graisses :

8-Récupérer le précipité de caillé obtenu la semaine précédente et le transférer dans un bécher de 400 ml.

9-Faire un montage à filtration sous vide avec un entonnoir Büchner de 7 cm et un papier-filtre Whatman #1. Puis, filtrez la solution de caillé en ne laissant passer que le liquide afin de conserver le maximum de solide. 

10-Ajouter 32 ml d’acétone, puis agiter et écraser les grains vigoureusement. Ajoutez et 32 ml de diéthyléther, agitez et écrasez les caillots durant une quinzaine de minutes. 

11-Filtrez la solution de caillé en ne laissant passer que le liquide afin de conserver le maximum de solide puis, laissez reposer la solution.

12-Ajoutez de nouveau 20 ml d’acétone puis 20 ml de diéthyléther et agiter vigoureusement durant quelques minutes. Laissez reposer un moment.

13-Filtrez la solution de caillé en ne laissant passer que le liquide afin de conserver le maximum de solide, puis laisser reposer. 

14-Ajoutez de nouveau 15 ml d’acétone puis 15 ml de diéthyléther et agiter vigoureusement durant quelques minutes et laissez reposer la solution un moment avant de filtrer de nouveau.

15-Lavez ensuite le solide du bécher de 400 ml avec 32 ml de diéthyléther et transférez le tout sur le filtre Büchner. Utilisez quelques millilitres pour déloger les derniers grains et les faires passer sur le filtre Büchner. 

16-Récupérer le filtrat, le solide sur le filtre et transvider le tout dans le bécher de 400 ml utilisés au départ. Sceller ce dernier avec du papier paraffine et entreposer. 

Résultats :

Tableau des masses :

Étape /substance	Masse (g)
5-Terre de diatomées	2,6  0,01
5-Charbon activé	1,5

Tableau des volumes :

Étape /substance	Volume (ml)
10- Acétone	32,0
10- diéthyléther	31
12-Acétone	18
12-Diéthyléther	20
14-Acétone	15
14-Diéthyléther	15
15-Diéthyléther	32

Observations semaine 2 :

La solution de lactose qui avait reposé durant une semaine s’était décantée, alors nous avons agité cette dernière afin de la rendre homogène. Il est important de ne pas concentrer la solution de lactose à moins de 75 ml afin d’éviter de brûler les molécules de lactose, c’est pour cette raison qu’il est important de bien agiter. Cependant, il se pourrait que des molécules de lactase aient été brûlées malgré l’agitation constante. L’ajout de la solution d’éthanol (molécule polaire) a permis de solubiliser complètement le lactose qui est une molécule polaire afin de récupérer dans le filtrat que la lactase à cristalliser. Le rôle du charbon activé est de capter les grosses molécules afin de purifier la solution. Quant à la terre de diatomées, elles recouvrent les pores du filtre afin d’empêcher les petites molécules de passer à travers le filtre. À l’aide de ces deux substances, on obtient un filtrat clair et sans impureté. Lors de la filtration, il reste des résidus dans le fond du bécher de 400 ml malgré le rinçage à l’éthanol. De plus, il se peut qu’il reste de la lactase dans chacun des filtres, car lors de la récupération du filtrat, les solides qui sont dans les filtres, soit la terre de diatomées et le charbon activé, étaient encore humides. La filtration à chaud permet au lactose de demeurer soluble, car dès la filtration terminée, des cristaux se forment au fond des petits béchers. Donc il est important de transférer leur contenu dans une fiole conique afin d’entreposer ce dernier et de permettre la cristallisation complète du lactose. Pourquoi ajouter encore de l’éthanol?

Semaine 1

Manipulations :

Séparer le caillé du lait :

1-Pesez 125,00 g (128,75 ml) de lait dans un bécher de 400 ml.

2-Chauffez le lait à 40° C en plaçant le bécher dans l’eau chaude ou sur un bain-marie.

3-Une fois les 40 °C atteints, retirez la fiole du bain et, à l’aide d’un compte-gouttes, ajoutez, lentement (goutte-à-goutte) et en agitant continuellement de 3,5 à 4,5 ml d’une solution d’acide éthanoïque (acide acétique) à 25 %.

4-Pour assurer une bonne coagulation, continuez à agiter le mélange tout en le refroidissant dans un bain d’eau froide.

5-Filtrez sous vide le caillé en utilisant un grand filtre Büchner de 7 cm de diamètre muni d’un papier-filtre à filtration rapides (Whatman #4) monté sur une fiole conique à vide de 500 ml (faire deux montages).

6-Rincez le bécher de 400 ml et le caillé sur le filtre avec environ 20 ml d’eau afin de diminuer les pertes. 

7-Transvider le contenu des deux fioles dans un bécher de 600 ml.

8- Récupérer le caillé et le transférer dans un bécher de 50 ml puis le sceller avec du papier paraffine, et ce, afin de l’entreposer.  

Cristalliser le lactose :

9-Au filtrat obtenu plus tôt, ajoutez environ 2,5 g de carbonate de calcium (CaCO₃) en poudre. 

10- Sceller ce dernier afin de l’entreposer pour poursuivre les manipulations à la semaine suivante.

Résultats :

Tableau des masses :

Étape /substance	Masse (g)
1-Lait 3,25%	125 0,01
9- Carbonate de calcium	2,5 0,01

Tableau des volumes :

Étape /substance	Volume (ml)
3-Acide acétique 25%	3,9 0,01

Observations semaine 1 :

En ajoutant l’acide acétique, il est important de mélanger constamment, car le pH doit être le même partout dans la solution afin que toutes les caséines soient précipitées. À la suite de cette étape, la solution devient quelque peu jaunâtre. Lors du transfert de cette solution dans les montages à filtration, il y avait des résidus dans le fond du bécher malgré le rinçage à l’eau distillée. La filtration de la solution caillée est très longue, cela nous a pris plus de 2h30. Nous avons dû faire deux montages de filtration pour réduire le temps toutefois, ceci a considérablement augmenté les pertes résiduelles, car il y avait des résidus sur les parois des entonnoirs Büchner, beaucoup sur les filtres (Whatman #4) même après avoir gratté à l’aide d’une spatule et quelque peu sur les tiges de verre ainsi que sur les spatules utilisées. Nous avons récupéré la solution de lactase dans deux fioles à vide alors, il faut considérer les pertes lors du transfert de la solution dans le bécher de 600 ml pour l’entreposage. Après la filtration, la solution de lactase récupérée était translucide et jaunâtre.  Le rinçage à l’eau du caillé avait pour but de récupérer le plus de lactase possible, toutefois, il en est resté donc nous devons considérer cette perte qui peut influencer nos résultats. 

Après l’ajout du carbonate de calcium dans la solution de lactase, le Ca+ deviendra un ion neutre tandis que le CO3-, va basifier la solution afin d’éviter que le lactose se défasse en glucose et galactose puisque dans les semaines suivantes, nous traiterons le lactose. Il serait bon, après avoir ajouté le carbonate de calcium, de vérifier, à l’aide d’un papier indicateur, la basicité de la solution.  

Réaction de précipitation des caséines:

(Ca²⁺ Caséines (charges négatives) + 2CH₃COOH →  Caséines neutres insolubles + Ca(CH₃COO)₂  

Réaction de neutralisation de l'acide acétique par le carbonate de calcium:

CaCO3    +   CH3COOH –»    C4H6CaO4   +      CO2↑      +      H2O

La réaction du lait qui caille en présence d’acide acétique :

Le lait est composé de micelles de caséines et de globules gras qui sont chargés négativement. De cette manière, les micelles demeurent en suspension et dispersées dans le lait puisqu’ils se repoussent entre eux formant une solution colloïdale. Lorsqu’on ajoute un acide au lait, la quantité de charges positives augmente neutralisant les charges négatives des colloïdes. Ainsi, ces derniers se déshydrateront et pourront se rapprocher dans la solution formant des grumeaux. Les micelles vont se lier par des interactions hydrophobes (liaison faible, réversible) en retenant dans leur réseau les globules gras, les micro-organismes, les vitamines, toutes les particules qui peuvent être retenues dans les mailles du réseau caséinique. On obtient un gel: c'est la coagulation lactique du lait.

Caséine : substance protéique qui constitue la majeure partie des composants azotés du lait. Dans la fabrication du fromage, elle précipite après l’ajout d'acide.

Micelle : agrégat sphéroïdal de molécules possédant une tête polaire hydrophile dirigée vers le solvant et une chaîne hydrophobe dirigée vers l'intérieur.